Après des cours au célèbre Lee Strasberg Institute (Actors Studio), elle décroche son premier rôle dans Coup de cœur de Francis Ford Coppola en 1982 aux côtés de Teri Garr et Harry Dean Stanton qui restera un mentor et un ami.

L’année suivante, elle s’impose aux côtés de Tom Cruise dans Risky Business, où elle joue le rôle sulfureux d’une call-girl qui fait passer un week-end incroyable à un garçon de bonne famille. Elle enchaîne rapidement avec Dernier testament avec le jeune Kevin Costner, puis Trip to Bountiful avec Geraldine Page. Mais sa carrière patine rapidement et manque d’être brisée en 1987 par l’échec critique et commercial du remake de Et Dieu… créa la femme que dirige Roger Vadim lui-même.

Elle revient progressivement grâce à des films comme Backdraft avec notamment Kurt Russell et Robert De Niro ou des mini-séries télévisées comme Une femme encombrante.

En 1992, c’est le retour en grâce quand La Main sur le Berceau cartonne au box-office mondial. Elle impressionne dans son rôle de baby-sitter diabolique et le film est reçu à Deauville. Pour ce film, Rebecca décroche le Prix d’interprétation au Festival du film policier de Cognac.

Elle devient alors très présente sur les affiches et en 1993, elle tient la vedette des films Angle mort avec Rutger Hauer, L’Avocat du diable avec Don Johnson, film également présenté à Deauville puis en 1994 Les Trois Mousquetaires dans lequel elle interprète Milady de Winter. En 1994, elle signe la réalisation d’un épisode de la série Au-delà du réel et partage la vedette du film Excès de confiance avec Antonio Banderas. À l’occasion de ce film, elle devient productrice exécutive.

Plus discrète par la suite, elle préfère de petites productions (The Winner avec Vincent D’Onofrio, Comme un voleur avec Alec Baldwin ou The Con avec William H. Macy) et multiplie les téléfilms.

Depuis 2003, Rebecca De Mornay est réapparue plusieurs fois au cinéma, souvent en guest star dans Identity avec John Cusack et Amanda Peet, Serial noceurs avec Vince Vaughn et Owen Wilson. En 2005, on la retrouve dans Raise Your Voice aux côtés d’Hilary Duff et dans les Seigneurs de Dogtown avec Emile Hirsh et Heath Ledger. En 2007 à la télévision, elle est l’une des principales interprètes de la série John from Cincinnati, qui ne comptera qu’une saison.

En 2011, Mother’s Day lui donne une nouvelle occasion de faire peur au public. Dans ce film, elle interprète en effet la mère psychotique de trois dangereux voyous qui ont séquestré un groupe d’amis dans leur ancienne maison.

Au printemps 2012, elle interprète, en tant qu’actrice invitée non créditée au générique, la mère de Finch dans American Pie 4 où elle campe une femme mûre attirante sur laquelle le rival de Finch, Stifler, a des vues.

Début 2013, elle est annoncée en tête du casting de la nouvelle série Hatfields and McCoys dont elle partagera la vedette avec Virginia Madsen et Sophia Bush. L’histoire raconte la guerre entre deux familles pour obtenir le contrôle de la ville de Pittsburgh. Cette série est produite par Charlize Theron.

Depuis, elle est apparue comme invitée dans des séries à succès : Hawaii 5-0 en 2013, Jessica Jones en 2015  et dans les saisons 1 et 2 de Lucifer.